单细胞Plus是结合单细胞转录组测序（scRNA-seq）与单细胞核转录组测序（snRNA-seq），兼顾两者优势，相得益彰，从而揭示更系统全面、深入精准的生物学机制的研究方法。下面通过几个典型文献案例来为您揭晓其中的缘由与奥秘。
生命现象的本质是复杂的细胞互作网络，类型各异的细胞相互通讯并执行特定功能，从而展现出丰富多彩的生理活动或状态各异的病理活动。单细胞测序，特别是单细胞转录组检测，通过在分子网络层面解析和鉴定细胞功能，回溯和还原组织内部的细胞网络，明确细胞的分子调控模式和状态变化，从而洞察生命现象背后的机制，业已成为生命科学研究中最强有力的技术手段。
(资料图片)
由于技术上的限制，scRNA-seq（这里特指使用完整细胞进行的检测）会造成细胞类型偏好性、应激基因偏好等缺陷，因此，学界转而利用snRNA-seq来避免这些不足。但snRNA-seq通常检测到的是组织中占有优势比例的细胞类型，例如心脏组织中大量获得的是心肌细胞，脑组织中获得的是神经元等等，这对一些课题造成了阻碍，例如更多关注免疫细胞功能的研究，因为很难捕获这些细胞类型而无法进行深入的分析。
基于各自技术的优势与劣势，目前学界逐步开始采用scRNA-seq与snRNA-seq结合的方式（我们称之为单细胞Plus）来开展单细胞的转录组研究，取得了很好的效果，具体体现在以下三个方面：
“应有尽有”
细胞Plus最直观的优点，就是获得的细胞图谱更完整，细胞类型应有尽有。例如在人类脂肪组织的研究中，snRNA-seq补充了Adipocyte、Mesothelium，并获得了更多的细胞数量【1】（图1）。同样的，在心脏组织中，snRNA-seq捕获了Endocardium、Cardiomyocytes等scRNA-seq缺少的细胞类型，使细胞图谱更加完整和全面【2】（图2）。而在肝脏中也取得了同样的良好效果【3】。因此，单细胞Plus能够解决scRNA-seq长期存在的细胞偏好性问题，收获更全面、更系统的细胞图谱。
另外，单细胞Plus更有助于挖掘稀有细胞类型或细胞亚型，例如对脂肪细胞不同亚型与各项疾病或身体指标的关联性分析，揭示了占比较少的细胞亚型与二型糖尿病高度相关【1】（图3）。通过这种“细致入微”的检测与分析，单细胞Plus能够解答更多样、更深入的生物学问题，并揭示其背后的分子机制，为高水平研究奠定了坚实的基础。
图1 人类脂肪组织单细胞Plus图谱
scRNA-seq与snRNA-seq的结合在脂肪组织中捕获了更为完整的细胞类型。引自【1】。
图2 人类心脏组织单细胞Plus图谱
scRNA-seq与snRNA-seq的结合在心脏组织中揭示了更丰富的细胞类型。引自【2】。
图3 人类白色脂肪细胞各亚型与不同疾病或身体指标之间的相关性分析
对白色脂肪细胞的独立分析显示其可以进一步划分为7个亚型，其中hAd7亚型与二型糖尿病高度相关，能够显著影响患病风险，尽管其数量仅占所有脂肪细胞的1%。引自【1】。
“洞察新机”
除了获得更全面的细胞图谱，借助分析scRNA-seq与snRNA-seq转录组的异同，单细胞Plus还能揭示全新的细胞调控机制。
在对果蝇精细胞发育的研究中，作者基于已知的干细胞会在细胞质中储存部分RNA，从而影响子代细胞分化的现象，通过对比scRNA-seq与snRNA-seq中转录本的异同，揭示了特定基因在精细胞发育过程中所扮演的特异性的调控作用【4】（图4）。类似的，在对蜘蛛胚胎的分析中，作者对比scRNA-seq数据，在snRNA-seq中鉴定到了独特的细胞类群，进一步的分析表明这个类群代表了细胞分化的一个过渡状态，这样就在整体上更加“动态”的解析了胚胎细胞的发育轨迹【5】（图5）。
这些基因的鉴定及其所“预示”的分子机制，为我们理解细胞命运分化、功能改变等提供了全新的视角，相比单独采用scRNA-seq或snRNA-seq，能够获得更多不同层面的细胞调控机制。因此，在单细胞转录组研究越来越多的当下，单细胞plus能够带来更多差异化的创新点，拓宽课题探索的范围，增加研究的深度，帮助我们取得更新颖和更广泛的突破。
图4 单细胞Plus解析干细胞分化的调控基因
热图展示了随着细胞分化的进行（图片上部横轴显示的时期），同样的基因在scRNA-seq与snRNA-seq数据中拥有不同的表达模式，提示这些基因在细胞分化过程中可能被储存在细胞质中以调控分化进程：如下半部分的warped pseudotime图示。引自【4】。（注：因图片过大，热图仅展示了一部分）。
图5 单细胞Plus揭示更细致的细胞状态变化
通过scRNA-seq与snRNA-seq的对比揭示了更为动态的图谱变化：snRNA-seq中cluster 9是外胚层细胞（mesodermal cell）的一种终末分化类群（posterior terminal cell population），暗示了一种正在出现的细胞状态（emerging cell states）。引自【5】。
“因势利导”
随着成本的降低和数据的积累，单细胞转录组测序已经成为生命科学研究的“常规工具”，未来的研究将越来越追求更全面、更深入、更丰富的细胞调控机制。从技术角度来说，单细胞Plus很好的贴合了这一趋势，能够帮助我们获得更加系统的洞见。而从最“直观”的逻辑角度来看，更多的细胞数量，意味着更多的生物学“故事”。因此，单细胞Plus将成为未来单细胞组学研究的重要方法。
例如近期的植物学研究，也开始采用单细胞Plus的方式【6】（图6），通过scRNA-seq提供的深度以及snRNA-seq揭示的广度，以纤毫毕现的精度展示了玉米（Zea mays）、高粱（Sorghum bicolor）、狗尾草（Setaria viridis）三种植物的单细胞分辨率的泛转录组（pan-grass transcriptome），为研究植物进化提供了更系统、更精准的图谱，并为育种、作物改良等带来了全新的见解与思路。
图6 玉米根的单细胞Plus图谱
scRNA-seq提供了深度，snRNA-seq揭示了广度，汇总成了更系统的图谱。引自【6】
参考文献
1.A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue. Nature. 2022 Mar;603(7903):926-933
2.Single-cell transcriptomics reveals cell-type specific diversification in human heart failure. Nat Cardiovasc Res. 2022 Mar;1(3):263-280
3.Single-Cell, Single-Nucleus, and Spatial RNA Sequencing of the Human Liver Identifies Cholangiocyte and Mesenchymal Heterogeneity. Hepatol Commun. 2022 Apr;6(4):821-840.
4.Emergent dynamics of adult stem cell lineages from single nucleus and single cell RNA-Seq of Drosophila testes. Elife. 2023 Feb 16;12:e82201
5.Reconstruction of the Global Polarity of an Early Spider Embryo by Single-Cell and Single-Nucleus Transcriptome Analysis. Front Cell Dev Biol. 2022 Jul 22;10:933220.
6.A pan-grass transcriptome reveals patterns of cellular divergence in crops. Nature. 2023 May;617(7962):785-791.
关键词：
